Mengenal Alat Analisa Molekuler; DNA Sequencing, DNA Microarray, dan Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

Penulis: Roni  Ridwan

Suatu penemuan penting dalam perkembangan biologi molekuler adalah teknik pembacan sequen potongan DNA secara cepat. Ada dua cara yaitu metode Maxam-Gilbert yang juga dikenal sebagai pendekatan degredasi fragmen DNA secara kimiawi (chemical degredation method) dan metode Sanger atau dikenal juga dengan pendekatan sintesis molekul DNA dan pemberhentian sintesis tersebut pada basa tertentu (chain termination atau dideoxy method).
Kedua metode tersebut menggunakan polyacrilamide gel electrophoresis untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA yang berbeda ukuran. Pada umumnya metode Sanger lebih banyak digunakan karena lebih mudah, praktis dan efisien (Balsover et al., 1997; Stanfield et al., 1996). Pada saat sekarang sudah banyak bermunculan DNA sequencer model baru dan kerjanya lebih cepat dan akurat. Prinsip dari DNA analyzer adalah elektroforesis secara otomatis dengan kafiler dari sekuen DNA yang telah dilabel dengan ddNTPs dan divisualisasikan dalam kromatogram oleh komputer.

Kemajuan teknik molekuler mendorong untuk menditeksi keseluruhan ekspresi gen dari sel atau jaringan suatu mikroorganisme. DNA microarray dapat melakukan analisis gen dengan jumlah yang banyak sekaligus dan dapat digunakan dalam assay ekspresi gen. Assay ekspresi gen itu dapat dilakukan pada satu jenis sel atau jaringan serta pada dua tipe sel atau jaringan yang berbeda misalnya sel darah dengan sel syaraf. Proses visualisasi microarray adalah salah satu informasi yang dapat memecahkan masalah yang terjadi dalam biologi molekuler dan bioinformatik. Ilmuan biologi dan bioinformatik menggunakan teknologi microarray untuk mengidentifikasi gen dalam sequen dan memprediksikan fungsi dari gen yang telah teridentifikasi dengan system yang luas. Teknologi DNA microarray berdasarkan pelabelan pada sample dengan label fluorescen yang berbeda dan selanjutnya dilakukan hibridisasi. Ditektor alat ini akan menditeksi pada sample yang telah hybrid dengan memancarkan fluorescence (Bajcsy, searching Juni 2007).

Jumlah copy number suatu DNA dari waktu ke waktu dapat dianalisis dengan menggunakan Real Time PCR. RT-PCR dapat melihat dengan jelas banyak kuantifikasi pertambahan dari hasil PCR yang diperoleh dari waktu ke waktu. Untuk menditeksi tahap demi tahap dilakukan penggunaan fluorescence dye spesifik dan non spesifik sehingga detector dapat menangkap pancaran dari fluorescence sebagai tanda amplifikasi DNA.

DNA Sequencing 

Pada awalnya sequencing menggunakan larutan utama di dalam reaksi metode Sanger yaitu dNTPs (Deoxynucleotides Triphosphates) untuk mensintesis molekul DNA baru dan ddNTPs (Dideoxynucleotides Triphosphates) yang akan menghentikan pemanjangan molekul DNA pada basa tertentu. Hasil akhir dari reaksi tersebut adalah sejumlah potongan DNA yang panjangnya bervariasi tetapi semuanya berakhir dengan nukleotida A (jika dNTP dicampur dengan ddATP) berakhir dengan nukleotida C (jika dNTP dicampur dengan ddCTP), berakhir dengan nukleotida G (jika dNTP dicampur dengan ddGTP) dan berakhir dengan nukleotida T (jika dNTP dicampur dengan ssTTP) (Balsover et al., 1997; Stanfield et al., 1996).

Seiring dengan perkembangan zaman, telah dikembangkan mesin sekuensing yang tidak lagi menggunakan 4 tabung untuk mencapur dNTPs dengan masing-masing jenis ddNTP. Mesin sekuensing ini mensyaratkan proses cycle sequencing pada sampel yang telah dipreparasi sebelum di runing dalam mesin. Cycle sequencing adalah metode pelabelan DNA dengan ddNTP yang telah dilabel dengan dye fluorescence melalui proses mesin PCR. Bahan yang dibutuhkan berupa master mix PCR biasa ditambah dengan ddNTP yang berfungsi sebagai terminator sehingga rantai DNA tidak terpolimerisasi pada ujung 3' OH.

Salah satu contoh mesin sekuensing otomatis adalah Applied Biosystem (AB) PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystem, searching, Juni 2007). Langkah-langkah yang harus dilakukan untuk sekuensing adalah preparasi sampel yang dilanjutkan dengan pelabelan dengan cycle sequencing, sampel dimurnikan kembali kemudian di run (elektroforesis) di dalam mesin sekuensing.

Mesin sekuensing otomatis telah terhubung dengan perangkat lunak yang akan menghasilkan output yang dapat kita mengerti dengan mudah. Hasil keluaran berupa sekuen basa-basa nukleotida yang harus diproses lebih lanjut sesuai tujuan. Hasil analisis sekuensing dapat diaplikasikan untuk memecahkan kasus-kasus kriminal, menjelaskan kekerabatan organisme dan mensekuen genom manusia yang penting untuk mempelajari penyakit-penyakit genetic dan lain sebagainya.

Hasil dari DNA analyzer berupa urutan sequen nukleotida dan ditampilkan dalam bentuk fasta. Analisis lebih lanjut dapat dipergunakan untuk kegiatan bioinformatika yang memerlukan format fasta dari sequen baik DNA atau nukleotida.. Fasta ditemukan oleh David Lipman dan Bill Pearson pada tahun 1985 yang membawa banyak manfaat untuk memproses pensejajaran dengan BLAST2 yaitu murah, cepat dan dapat kemudahan akses (Taylor, 2000). 

Bahan yang akan dianalisis adalah DNA berlabel yang berfungsi sebagai template yang akan disekuen, ditambahkan master mix PCR, ddNTPs, dye fluorescens, dan buffer yang dilakukan cycle sequencing pada mesin PCR. Seperangkat piranti Applied Biosystem (ABI) prism 3100 Gwnwtic Analyzer (Gambar 1) yang juga dilengkapi perangkat lunak dan keras komputer.

Prinsip kerja 

Preparasi sample: Sample yang akan disekuen dapat berasal dari hasil klon atau hasil PCR. Lebih baik DNA template berasal dari hasil klon, hasil PCR memerlukan tahapan purifikasi lagi.

Cycle sequencing: proses pelabelan DNA dengan ddNTP yang telah dilabel dengan dye fluorescens dengan mesin PCR. Bahan yang dibutuhkan berupa master mix PCR biasa ditambah dengan ddNTP yang berfungsi sebagai terminator sehingga rantai DNA tidak terpolimerisasi pada ujung 3' OH. 

Purifikasi: furifikasi lanjutan diperlukan jika DNA template yang digunkakan merupakan hasil PCR. Purifikasi ini bertujuan untuk membersihkan DNA template dari sisa-sisa pereaksi PCR.

Denaturisai pada suhu 95 oC selama 2 menit: denaturisasi berfungsi memisahkan double strain DNA menjadi utas tunggal yang merupakan syarat DNA template.

Run (elektroforesis di dalam sekuenser); elektoforesis dalam sekuenser pada prinsipnya terdiri atas 4 tahap yaitu injeksi polimer pada kafiler sebagai media untuk migrasi DNA, pengambilan sample DNA yang telah dilabel dari ujung kafiler lainnya, migrasi seperti prinsif elektroporesis biasa, penembakan fragmen-fragmen DNA yang telah dilabel oleh laser dan ditektor menangkap pancaran dari masing-masing intensitas  yang selanjutnya dioleh dalam komputer dan disajikan dalam kromatogram (Gambar 2.).

DNA Microarray

Eksperimen cDNA microarray memperlihatkan ekspresi gen pada beberapa ribuan gen yang mengukur secara simultan. Sequen DNA dari gen interes di print pada glas slide mikro menggunakan robot array (Gambar 3). Kemudian kelimpahan dari sequen DNA dalam dua sample mRNA dibandingkan. Dua sampel mRNA dilakukan pelabelan dengan dua dye yang berbeda, yang satu dengan green fluorescence Cy3 dan yang satu lagi dengan red-fluorescence Cy5.  Keduannya dicampur dan di co-hybridisasi pada slide microarray.  Sinyal dibaca dengan menggunakan fluorescence visualisasi system seperti con-focal scanner. Dalam banyak percobaan microarray menjadi kunci pertanyaan adalah yang mana gen-gen adalah berbeda mengekspresikan dalam dua sample asli (Rahnenfuhrer, et al., 2003). 

Prinsip microarray adalah imobilisasi cDNA atau oligonukleotida target pada slide (menggunakan array sebagai probe), hibridisasi dengan campuran cDNA terlabel (Cy3 dan Cy5), dan diteksi hibridisasi dengan laser reader atau scanner (dilengkapi dengan mikroskop dan kamera. Imobilisasi dapat dilakukan pada slide glas mikroskop, chip silicon dan membrane nyilon. Proses microarray pertama melakukan klon cDNA, pustaka oligo (gen target), printing oleh robot array (0.1 nl/spot). Selanjutnya disiapkan tipe liar yang dilabel oleh Cy3 dan sample yang telah ditreatmen dilabel dengan Cy5 dan dicampurkan. Tahap berikutnya dilakukan hibridisasi gen target di slide dalam UV crosslinker (gambar 4.b). Dilakukan scanner untuk menditeksi intensitas fluorescen (Gambar 4.a), step terakhir adalah menganalisis data yang menampilkan ekspresi gen yang berbeda. 

Penggunaan microarray dalam biologi 1) genomics; dapat digunakan untuk ekspresi gen, siRNA creens, dan CGH (comparative genomic hybrization), 2) proteomic; peptide array dan ELISAs. Metode DNA microarray untuk menganalisis sequen asam nukleat yang komplek sekarang dapat dilakukan dengan cepat, efisien dan akurat pada level seluruh ekspresi gen dalam sampel biologi. Dua issue yang penting dalam menghasilkan data microarray, yang pertama menentukan mana gen yang bagus mendeskriminasi diantara tipe berbeda pada jaringan, yang kedua mengkarakteristik dari ekspresi gen dalam jaringan tumor (Ibrahim, et al., 2002). Warna yang diperlihatkan oleh scanner microarray adalah hijau memperlihatkan DNA control, merah memperlihatkan sample DNA (treatment), dan kuning memperlihatkan ekspresi dari keduannya (Gambar 5).

Real Time PCR

Proses Real Time-PCR mengamplifikasi gen sama seperti PCR biasa namun pada RT-PCR gen dapat diamati pada setiap tahapnya dan dapat diukur jumlah kopi yang telah diamplifikasi. Pada mesin ini dibagi menjadi dua tahap 1) Proses amplifikasi dengan  PCR biasa hanya pada RT-PCR dilakukan pelabelan probe oleh dye warna yang menempel pada ds DNA yang mempunyai reporter dan quencher. Warna yang digunakan ada dua yaitu warna annealing spesifik (taqman) dan annealing nonspesifik (SyBR GreenI dan EtBr) 2) Deteksi, pada bagian ini dilengkapi dengan kamera yang langsung dihubungkan dengan komputer dan detector penangkap intensitas cahaya fluorescence (Gambar 6).  

Alat Real-time PCR IQ5 real-time PCR detecting system (Gambar 7) dari BIO-RAD, RT-PCR pada saat ini baru mampu untuk mendeteksi lima jenis warna (fluorescence) yang berbeda untuk multiplex PCR. 

Prinsip kerjanya adalah probe dye warna dilakukan pencampuran antara reagen mastermix dengan sample yang akan menempel pada dsDNA. Pada saat amplifikasi taq DNA polymerase mempunyai aktivitas 5' exo-nuklease yang akan mendegradasi probe yang menempel pada dsDNA. Reporter akan lepas dan memendarkan cahaya fluorescen dan ditangkap oleh detector yang selanjutnya divisualisasikan pada computer berupa grafik pertambahan copy number DNA secara kuantitas (Shipley, searching Juni 2007). Pada saat belum terjadi amplifikasi pancaran cahaya fluorescen ditangkap oleh quencher sehingga tidak mempengaruhi detector RT-PCR (Gambar 8).  

Alat ini dapat menganalisis banyak sampel sampai 96 buah dan terhubung dengan komputer yang dilengkapi dengan software untuk analisis data sehingga memudahkan untuk melakukan analisis dan interpretasi data. Visualisasi data hasil analisis RT-PCR berupa grafik dan nilai kuantifikasi berupa jumlah copy number DNA setelah di aqurasi dengan nilai ambang.(Gambar 9). Hubungan CT (cycle threshold) dengan copy number, ct adalah nilai perpotongan antara tingkat fluorescen sample dengan nilai ambang rata-rata pada saat itu. Jika jumlah DNA besar maka nilai ct yang harus dicapai cepat atau kecil, dan sebaliknya kalau jumlah DNA kecil maka untuk mencapai nilai ct cukup lama dan besar.

Daftar  Pustaka

Balsover, S.R., J.S. Hyams, S. Jones, E.A. Shepard & H.A. White. 1997. From Genes to Cells. John Wiley & Sons. New York.

Ibrahim, J.G., M. Chen & R.J. Gray. 2002. Bayesian models for gene expression with DNA microarray data. Journal of the American Statistical Association Vol. 97, No. 457.

Rahnenfuhrer, J. & A. Fuschik. 2003. Cost-effective Screening for Differentially Expressed Genes in Microarray Experiments Based on Normal Mixtures. Australian journal of Statistics. Vol.32, No. 3, p.225-238.

Bajcsy, P. Searching-Juni 2007. An Overview of DNA Microarray Image Requirements for Automated Processing. National Center for Supercomputing Applications (NCSA), University of Illinois at Urbana-Champaign (UIUC).

Applied Biosystem. Searching-Juni 2007. Real-Time PCR Vs. Traditional PCR.

Shipley, G.L. Searching-Juni 2007.Quantitative Real-Time RT-PCR. A Very Short Course. Department of Integrative Biology & Pharmacology University of Texas Health Science Center – Houston Houston, Texas.

Stanfield, W.D., J.S. Colome & R.J.Caro.1996. Molecular and Cell Biology. Mc Graw-Hill.New York.

Taylor, H.D. 2000. Bioinformatics Sequence; structure & data banks; a practical approach. Oxford University. New York.